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载体构建相关实验详解

发布时间:2022-07-07 12:55:58 来源:牛宝体育app 作者:牛宝官网下载

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  常规载体构建原理及流程较为简单,具体操作也比较容易。这里进行简单总结,并对几点需要注意的点进行说明。

  原理依赖于限制性核酸内切酶,DNA连接酶和其他修饰酶的作用,分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后,将二者连接在一起,再导入宿主细胞,实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

  p CMV启动子(以及其他的启动子SV40、bla、T7……):高效率启动基因表达。

  限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的核苷酸序列,并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶,简称限制酶。

  根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式,可将限制酶分为三种类型,分别是第一型(Type I)、第二型(Type II)及第三型(Type III)。

  Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化,又催化非甲基化的DNA的水解;

  可识别DNA序列中的回文序列,并对两条链上特定碱基之间的磷酸二酯键进行切割;

  找到目的基因的序列之后,就需要选择合适的酶切位点,因为只有确定了合适的酶切位点才可以进行引物设计。

  1、通常我们会使用双酶切,因为单酶切后载体容易自连;且不能保证目的基因插入的方向性。

  2、双酶切需要注意同尾酶的自连。比如下图中BamHI和BGl II虽然识别的序列不同,但是酶切后的末端是相同的,这种情况在选择酶切位点时应避免。

  那这里怎么检查我们的目的基因序列中有没有选定的酶切位点的序列呢?总不能一个一个去查找吧?这里给大家推荐一个在线工具。

  只要是这里显示none的,即为目的序列中不包含对应酶切位点的序列,也就是说可供使用。

  再来选取下游引物,注意,在选取下游引物时要去掉终止密码子,且需反向互补。

  然后给引物5‘端加上我们选定的酶切位点的序列,再加上保护碱基。这时需要注意,不能造成移码突变。

  然后扩增目的基因,对载体进行酶切,目的基因和载体连接,转化,检测,提质粒。测序……

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